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人参皂苷Rh2联合顺铂对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响

2017.04.16  关注 评论 相关内容

卵巢癌一般来讲发现都在晚期,早期没有什么较好的诊断措施,说实话,卵巢癌晚期,基本没法治了,只能通,现在以转移肺部了,有胸腹水带血色,肚子胀痛脚肿,又不想吃,大小便有,卵巢局部有占位,而且确诊是有癌细胞,这样的情况卵巢癌的可能是比较大的,为了确诊是否为卵巢癌的情况,建议进行其他的方面检查,如果除外其他的器官癌症的情况就可以确诊是这个卵巢癌的。

【摘要】目的: 探讨人参皂苷Rh2 联合顺铂对于人卵巢癌细胞株SKOV-3 的影响。方法: 采用MTT 比色法检测人参皂苷Rh2 与DDP 联合应用对SKOV-3 细胞株增殖的影响,利用流式细胞仪分析细胞周期及凋亡情况,并计算细胞平均凋亡率,利用Western-blot 技术观察SKOV-3 细胞内HER-2 蛋白的表达。结果: ①Rh2 与DDP 联合应用分别作用于SKOV-3 卵巢癌细胞株,单独应用DDP 350 μmol /L 和600 μmol /L IC50 降为DDP 250 μmol /L 和300 μmol /L。②流式细胞术检测显示,DDP + Rh2组凋亡率在SKOV-3 细胞系中为32. 2%,SKOV-3 细胞被阻止于G1 期,在SKOV-3 DDP 细胞中为12. 5%,均显著高于仅应用DDP 组细胞( P < 0. 05) ,SKOV-3 DDP 细胞亦被阻止于G1 期。③Western blotting 结果显示,SKOV-3 细胞中DDP + Rh2 组HER-2 蛋白表达较对照组、DDP 组、Rh2 组显著降低( P < 0. 05) 。结论: 人参皂苷Rh2 与DDP 联合应用对SKOV-3 卵巢癌细胞株有促凋亡作用,并改善卵巢癌细胞株SKOV-3 DDP 对DDP 的敏感性。

【关键词】人参皂苷Rh2 ;顺铂;细胞凋亡;卵巢癌

细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程,许多抗癌药物作用机制均为诱导肿瘤细胞的凋亡,能否有效的诱导细胞凋亡也就成为筛选抗癌药物的新标准。人参单体皂苷Rh2 具有较强的抗肿瘤活性,无明显的毒副作用,是理想的抗肿瘤药物,其潜在的抑癌作用已经引起许多科研工作者的重视。顺铂( cisplatin,DDP) 是广谱抗肿瘤药物,可诱导多种肿瘤细胞的凋亡,但对胃肠道、肾、神经系统及骨髓毒性大。该研究探讨Rh2 联合顺铂诱导卵巢癌SKOV-3 细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1. 1 材料卵巢癌细胞株SKOV-3、SKOV-3 DDP 为该实验室传代保存。人参皂苷Rh2 由吉林大学药学院提供。HER-2兔抗人抗体及二抗均为Santa Cruz 和Cell Signaling 公

司产品,蛋白定量试剂盒为美国Bio-Rad 公司产品。细胞裂解液为Cell Signaling 产品,蛋白酶抑制剂、磷酸化酶抑制剂为Roche 公司产品,小牛血清为杭州四季青生物有限公司产品,顺铂为江苏豪森药业股份有限公司产品,胰蛋白酶为Sigma 公司产品; 四甲基偶氮唑蓝( MTT) 为Sigma 公司产品; 其他试剂为进口或国产分析纯。

1. 2 方法

1. 2. 1 细胞培养人卵巢癌SKOV-3、SKOV-3 DDP 细胞株均培养在含10% 小牛血清的RPMI-1640 培养液中,置37℃,5%CO2的培养箱中,待细胞80%融合时,分组加药。

1. 2. 2 MTT 法检测细胞活性SKOV-3 细胞取对数生长期的SKOV-3 细胞、SKOV-3 DDP 细胞接种于96 孔培养板( 1 ×104 /孔) 。加入终浓度分别为10、20、40、80 μmol /L 的人参皂苷Rh2,对照组不加药,每孔设4 复孔。37℃、5% CO2孵育48 h。每孔加入5 mg /ml MTT 20 μl,37℃,5% CO2培养4h,轻轻吸去上清,再加入100μl 的DMSO(二甲基亚砜),微振器上振荡10min,测定570 nm 波长的吸光度( A) 值。细胞增殖抑制率( %) = ( 对照组A 均值- 实验组A 均值) /对照组A 均值×100%。计算各组抑制率,绘制细胞增殖抑制曲线图,计算IC5 ( 无毒浓度) 。MTT 法测定顺铂对SKOV-3 细胞、SKOV-3 DDP 细胞的IC50 和IC20 ( < IC30 为低效浓度) 。MTT 法测定10μmol /L Rh2 与DDP 联合对SKOV-3、SKOV-3DDP 细胞的IC50。实验重复3 次。

卵巢局部有占位,而且确诊是有癌细胞,这样的情况卵巢癌的可能是比较大的,从网上看似乎患上卵巢癌,尤其是晚期的5年存活率很低,为什么呢?。

1. 2. 3 流式细胞仪检测细胞周期将对数生长的SKOV-3细胞、SKOV-3 DDP 细胞分成4 组。对照组细胞加入PBS;DDP 组细胞加入低效浓度DDP; Rh2 组细胞加入无毒浓度

Rh2; DDP + Rh2 组: 细胞加入低效浓度DDP 和无毒浓度Rh2。以下实验每组5 个样本,实验重复3 次。将生长状态良好的SKOV-3、SKOV-3 DDP 细胞同前分为4 组加入相应处理因素,培养48 h 后,分别收集细胞,将细胞沉淀用1 ml 注射器快速推入70% 冷乙醇中,4℃固定12 h 以上。PBS 洗2次除去乙醇,调整细胞浓度为1 × 106 /ml,用RNase 消化后,加入1. 5 ml 碘化丙啶( PI,5 mg /100 ml) 对DNA 进行染色。细胞经过滤、混匀后在流式细胞仪上进行分析。每份样品检测1 × 104 细胞。G1 峰前面出现的亚2 倍体峰即为凋亡峰。实验重复3 次,测定出细胞周期中各时期细胞的百分比,计算凋亡率。

1. 2. 4 Westen blotting 检测蛋白表达细胞加药后48 h 提取细胞总蛋白。采用BCA 方法进行蛋白定量,取300μg 蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳,电转蛋白至NC 膜上,封闭过夜后分别室温加入1∶ 1 000 兔抗人HER-2 抗体,洗膜,加入二抗,采用ChemiDoc XRS 系统捕捉化学发光信号。QUANTITYOne 4. 5. 0 分析软件定量分析HER-2 蛋白及内参蛋白GAPDH的OD 值,以相对积分光密度OD 值比较蛋白表达量的高低。实验重复3 次。

1. 3 统计学处理采用SPSS 17. 0 统计软件进行统计学分析,计量数据采用t 检验,计数资料采用χ2 检验。

2 结果

2. 1 DDP 及Rh2 对细胞生长的影响DDP 对SKOV-3 细胞的IC50 为350μmol /L,对SKOV-3 DDP 细胞的IC50 为600 μmol /L。≤10 μmol /L 的Rh2 对细胞无明显抑制作用。10μmol /L Rh2 与DDP 联合,分别作用于SKOV-3、SKOV-3DDP 细胞, IC50 分别降为DDP 250 μmol /L 和300μmol /L。取低效浓度的DDP 和无毒浓度的Rh2 为联合用药组,进行流式细胞和Western blotting 检测。各组细胞给药浓度见表1。

2. 2 流式细胞检测结果处理SKOV-3 细胞48 h 后,与对照组相比,Rh2 组S 期、G2 /M 期细胞数减少,G1 期细胞数明显增多,达56. 1%; DDP 组细胞G2 /M 期细胞减少,S 期细胞明显增多,达35. 8%; DDP + Rh2 组G2 /M 期细胞减少,G1期细胞数明显增多,达65. 2%。处理SKOV-3DDP 细胞48 h后,与对照组相比,Rh2 组细胞S 期、G2 /M 期细胞数减少,G1 期细胞数明显增多( 51. 5%) ; DDP 组细胞G2 /M 期细胞减少,S 期细胞明显增多( 26. 9%) ; DDP + Rh2 组G2 /M 期细胞减少,G1 期细胞数明显增多( 61. 9%) 。在SKOV-3 和SKOV-3 DDP 细胞系中,Rh2 组细胞阻滞于G1 期,DDP 组细胞阻滞于S 期,DDP + Rh2 组细胞阻滞于G1 期。见表2。

流式细胞结果显示,SKOV-3 细胞中,与对照组比较,DDP 组和DDP + Rh2 组细胞均出现较明显的凋亡,DDP 组凋亡率为15. 1%,DDP 联合Rh2 组凋亡率为32. 2%,二者相比差异有统计学意义( P < 0. 05) 。SKOV-3 DDP 细胞中,与对照组比较,DDP 组和DDP + Rh2 组细胞均出现较明显的凋亡,DDP 组凋亡率为5. 0%,DDP + Rh2 组凋亡率为12. 5%,二者相比差异有统计学意义( P < 0. 05) 。两细胞系DDP + Rh2 组凋亡率与DDP 组相比均有统计学差异( P < 0. 05) 。见图1。

2. 3 Western-blot 检测结果给药48 h 后提取细胞总蛋白进行Westen blot 分析,Quantity 软件分析得到蛋白表达量,用内参GAPDH 去除组间差异,SKOV-3 细胞Her-2 蛋白相对表达量对照组为( 5. 5 ± 0. 2) ,DDP 组为( 3. 1 ± 0. 2) ,Rh2 组为( 3. 7 ± 0. 3 ) ,DDP + Rh2 组为( 0. 9 ± 0. 2 ) , 四组中DDP + Rh2组的蛋白表达量最低( P < 0. 05) 。见图2。

3 讨论

随着化疗药物的应用,部分卵巢癌对化疗药物的敏感性逐渐降低,因此增强卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性成为治疗卵巢癌及改善预后的关键。人参皂苷- Rh2 ( G-Rh2) 是从人参中分离得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体。G-Rh2抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点,可通过多种途径抑制肿瘤细胞的生长。如调节肿瘤细胞信号通路系统、逆转肿瘤细胞的异常分化与诱导细胞凋亡等。顺铂( DDP) 是治疗肿瘤的重要化疗药物之一。主要作用靶点为DNA,可抑制癌细胞的DNA 复制过程,抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡,是细胞周期非特异性药物。DDP 对肿瘤细胞的抑制作用与药物剂量呈正相关,即药物剂量越高对肿瘤细胞的抑制作用越强。但高剂量的DDP 对机体有较强的不良作用,如对骨髓细胞的抑制、肾脏毒性、耳毒性、胃肠道反应等,明显限制了其在临床治疗中的应用及治疗强度。研究通过比较单独应用G-Rh2、DDP 及联合应用二者对人卵巢癌细胞株SKOV-3,SKOV-3 DDP 的作用,说明二者联用可提高DDP 诱导卵巢癌细胞的凋亡作用,增强卵巢癌细胞对DDP 的敏感性。原因可能是二者通过不同途径诱导肿瘤细胞凋亡,在诱导细胞凋亡过程中产生了协同作用。流式细胞检测结果显示,联合应用G-Rh2 及小剂量DDP 时肿瘤细胞主要表现为G-Rh2 对卵巢癌细胞的G1 期有阻滞作用,被阻止于G1 期的卵巢癌细胞对DDP 敏感,增强了小剂量DDP的细胞毒性。这与相关文献报道的二者协同可增强小剂量DDP 抗前列腺癌作用的结论一致。此外,G-Rh2 可以逆转肿瘤的耐药性,可以作为肿瘤耐药逆转剂提高化疗药物的抗肿瘤活性。部分耐药的肿瘤细胞P-糖蛋白表达升高,P-糖蛋白是由多药耐药( MDR1) 基因编码产生的一种跨膜糖蛋白,能将肿瘤细胞内的抗肿瘤药物逆浓度转运出细胞,降低细胞内药物浓度而导致肿瘤耐药。但G-Rh2 具有可亲水及亲油的特性,可以轻易进入细胞核内诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。联合应用G-Rh2 能改善人卵巢癌细胞株SKOV3DDP 对DDP 的敏感性的原因。Her-2 基因即c-erbB-2 基因,定位于染色体17q12 -21. 32 上编码的产物为分子量185kD ( p185) 具有酪氨酸激酶活性跨膜糖蛋白,是表皮生长因子家族成员之一,可与家族中其他成员,如HER-1、HER-3 及HER-4 等形成异源二聚体或与自身行成同源二聚体而被激活,从而发挥其生物学活性。大量研究表明,HER-2 在细胞信号转导过程中起重要作用,其被激活后可启动细胞内强大的信号转导网络,引发一连串“瀑布式”反应,影响肿瘤细胞的生长、分化、转移和黏附。Slamon 等首次发现,Her-2 基因在人卵巢癌组织中过度表达。已有大量研究表明,Her-2 在卵巢癌细胞中的表达可影响卵巢癌的分化、转移及其对化疗药物的耐药性,与卵巢癌的预后呈负相关,可作为评估卵巢癌预后的独立因素。Pietras 等和Bergman 等研究发现,p185 过度表达的肿瘤细胞对损伤的修复能力增强,可能是导致Her-2 基因阳性表达肿瘤细胞对DDP 耐药的关键原因。研究显示,应用G- Rh2 后SKOV-3 细胞株中Her-2 基因的表达下调。因此推测G-Rh2 可能是通过下调Her-2 基因减少p185 表达,改善人卵巢癌细胞株SKOV-3 DDP 对DDP 的敏感性。

为了确诊是否为卵巢癌的情况,建议进行其他的方面检查,如果除外其他的器官癌症的情况就可以确诊是这个卵巢癌的,人参皂苷类药物能作为放化疗的一种治疗辅助药物,对于疾病本身的治疗虽然国内外的研究表明有一定的价值,但实际临床应用并没有很广泛使用,卵巢癌总体上5年生存率低,而卵巢癌晚期事实上是3年生存率低——卵巢癌往往恶性程度高,病情发展迅速,容易腹膜腔广泛转移,晚期的情况难以长期抑制病情进展,通常会形成严重消耗,直至油尽灯枯,啥比较,看效果呗,哪个吃了面色红润有光泽哪个就好,都去吃吃看,反正我吃了今,幸,胶,囊饭量增了,我就觉得它好。

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